不同于宽场显微镜通过泛光照明和相机同时采集全视场图像的是，激光扫描显微镜通常在给定时间内只能用单焦点照明，并在完成逐行光栅式扫描(Raster Scan)后重构图像。光栅扫描一般通过两个反射镜(双轴振镜)实现。比如在右下图中，快速反射镜沿x轴扫描，慢速反射镜逐行推进。
宽场成像激光扫描成像
激光扫描成像相比宽场成像并没有本质上的优越性，但通过激光扫描能使用更高水平的成像技术，而共聚焦和多光子就是本文将要介绍的两种。共聚焦成像通过抑制焦点外的光产生高分辨率的图像，可通过光学切片重构三维图像，而双光子成像深度非常大。
宽场显微图形共聚焦显微图像
激光扫描引擎：规格的相互制约
扫描引擎的四个主要光学组件分别是扫描反射镜(振镜)、扫描透镜、套筒透镜和物镜。扫描反射镜位于扫描透镜的后焦平面上，扫描透镜和套筒透镜的间距等于扫描透镜前焦距与套筒透镜后焦距之和。虽然套筒透镜输出准直光束，物镜处于 wu 穷 远校正空间，所以两者间距没有那么严格的要求，但 zuihao使套筒透镜前焦平面和物镜后焦平面重合。
下图画出了每种组件的相对位置以及扫描角度的关系。扫描反射镜的角度Ω1将按照扫描引擎的放大率减小为Ω2，即光束进入物镜的角度。
扫描引擎的视场经常受限于扫描光学元件而不是物镜。扫描反射镜既有 zui大的离轴角，还因为光栅式扫描通常产生方形的扫描区域，即下图中的紫色方框，而扫描透镜和物镜的视场是圆形，分别表示为下图中蓝色和红色的圆形。
如果扫描透镜和套筒透镜的放大率为1，虽然这样不会减小光束进入物镜的角度，但会限制进入物镜的 zui大光束尺寸，使之无法充满物镜后孔径而降低分辨率。这是因为物镜后孔径充满均匀的平顶光才能达到衍射 ji 限 分辨率。而且，轴向分辨率比横向分辨率受此影响更大。
物镜分辨率(焦斑)和入射光束的关系
另外，实际样品还会引入散射和波前畸变而造成散焦。这个问题可能和数值孔径相关。对于折射率变化很大的生物组织，从高数值孔径入射的光线可能在焦点处造成相消干涉，从而扰乱波前并扩大焦斑。未充满的物镜可能没有这些高数值孔径的光线，因此提供 geng 好 的波前和更小的焦斑。
光束未充满物镜光束充满物镜
因此，分辨率与成像深度也是两个互相制约的因素，两者的关系形象地展示在下图中。光束过度充满物镜时可在组织表面附近得到高分辨率图像，但由于散射和其它波前误差无法太深入组织成像。光束未充满物镜时具有低分辨率，但成像更深。
扫描引擎：主要元件的性质
在介绍每个扫描组件之前先看下Thorlabs Bergamo?多光子显微镜的扫描引擎设计规格：
扫描透镜多数属于fθ校正的类型。这是因为简单球面透镜的焦平面是曲面，虽然平场透镜可校正场曲，但其焦点的距离与扫描角度不是线性关系也不是理想选择。另外，有些扫描引擎还使用远心透镜，使光垂直于像平面聚焦。这样光束可 gao 效 地通过光学元件，不会从系统外围逸出。扫描透镜的重要规格为焦距、入直径、视场数和设计波长范围。
各种扫描透镜
套筒透镜 shou先 也要关注焦距，因为它影响扫描引擎的放大率。di 二 是扫描透镜和套筒透镜中间像平面的视场大小，这两种透镜的视场 bi 须 匹配才能实现 gao 效 率扫描。第三是入直径，这其实是指物镜这一侧的光，它要和物镜后孔径一样大。第四是设计波长范围。
两种套筒透镜
扫描反射镜有两种：共振扫描反射镜(Resonance Mirror)和振镜扫描反射镜(Galvo Mirror)。前者用于平行于x轴快速扫描，后者用于逐行推进并提供回程。
Thorlabs高速共振扫描头
振镜(Galvo)反射镜可以 jing 确 控制扫描位置，但速度和加速度都比较慢，而且尺寸和速度是互相制约的。扫描引擎传输的光束尺寸受扫描反射镜尺寸限制，但使用大镜面又会降低速度。共振(Resonance)反射镜速度快，角度和时间为正弦关系。共振扫描只能控制振幅，而且越高的频率会使振幅略微降低。
扫描反射镜通常以两轴集成在一个扫描头中。振镜扫描仪(Galvo-Galvo)和共振扫描仪(Galvo-Resonance)是两种常见配置。振镜扫描仪可扫描视场中的任意点并停留任意时间，也能扫描任意形状，但速度慢。共振扫描仪速度快，但只能扫方形、矩形或直线，而且要沿轴向扫描。
振镜扫描任意形状共振扫描特定形状
振镜扫描仪由于加速度有限需要时间减速，因此会超出视场范围很多。左下图展示了利用振镜扫描仪故意漂白的图像，方框代表成像区域，但比较明显的是，实际扫描从两侧延伸出去了。
共振扫描仪在不同位置的停留时间差异很大，右上图是8 kHz共振扫描仪采集的图像。视场中间的停留时间约为0.1 μs，边缘的停留时间超过2 μs。由于扫描停留时间非常短，因此样品不容易被漂白。仔细看图中有两条暗线，使用高速功率调制器件可在视场边缘关闭激光而减少样品损伤。
激光扫描探测器要求速度快，在每个像素的停留时间通常不到0.1 μs，而且需要大传感器区域捕获尽可能多的光子。光电倍增管是激光扫描显微镜的传统选择。它们提供纳秒级上升和下降时间以及高动态范围和低读出噪声，但缺点是量子 xiao率 zui高 jin有 40%左右。
光电倍增管的替代品包括雪崩光电二极管。虽然这种探测器具有更高的量子效率，且速度很快，但动态范围较低，超过极低的光强范围就可能被损坏。近年来，硅光电倍增管有了很大的发展。
共聚焦扫描引擎
共聚焦的目的是抑制焦点外的光，从而获得更清晰的图像。这是因为如果样品较厚，焦点外的光打到探测器会使图像模糊。共聚焦的实施方法是在像平面加一个，使得只有来自焦平面的样品光能通过扫描引擎在上聚焦并进入探测器。焦点之外的光大部分都被外侧阻挡。
轴向共聚焦扫描离轴共聚焦扫描
共聚焦可通过Z-stack重构3D图像
多光子扫描引擎分别是单光子和双光子成像的电子能级图。对于单光子成像，gao 能 量蓝色光子将基态电子跃迁至激发态，然后在荧光寿命时间内弛豫至略低的能级，zui 后 从这里回到基态并发射一个能量略低的绿色光子。
多光子成像由于使用长波长因此能更深入组织成像，而且提供 tian 然 的光学切片功能。在的对比图中，单光子成像的激发区域呈沙漏形，而双光子成像只能看到焦点处的亮光。这是因为只有焦点处的光子密度高才能实现双光子激发，因此这是一种固有的光学切片，不会在焦点外产生荧光，也不用加。
单光子和双光子
实际样品成像对比
虽然在理想情况下探测器要以球面包围样品才能收集全部的光，但大多数多光子显微镜只是通过物镜收集。和共聚焦探测方式(De-scanned)不同的是，多光子显微镜直接在物镜后用二向色镜使荧光通过收集透镜进入探测器。
Non-Descanned探测方式
多光子提供深度成像，上面为1.2 mm深的脑图像
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